生物サンプルの赤外線（IR）イメージングにおいて、最も広く利用され強力な技術は フーリエ変換赤外分光法（FTIR）顕微鏡法です。この方法は、標準的なIR分光計と顕微鏡を組み合わせることで、タンパク質、脂質、核酸などの主要な生体分子の空間分布を明らかにする、化学的に特異的な画像を生成することができます。
生物学におけるIRイメージングの核となる課題は、単に技術を選択することではなく、探している分子データを覆い隠してしまう、圧倒的な水のIR信号を管理することです。したがって、装置とサンプル調製方法の両方の選択が成功のために極めて重要になります。
赤外線イメージングとは？化学マップ
振動分光法とも呼ばれる赤外線イメージングは、標準的な光学顕微鏡法とは根本的に異なります。形態を視覚化するだけでなく、サンプルの化学組成に関する情報を提供します。
画像を超えて：ハイパースペクトル画像の作成
IR顕微鏡は、画像内のすべてのピクセルで完全な赤外スペクトルを測定します。これにより、「ハイパースペクトルデータキューブ」が作成されます。これは、各層が特定のIR周波数での光の吸収に対応する画像のスタックです。
このデータを分析することにより、サンプル全体の特定の化学成分の濃度と分布をマッピングする偽色画像を生成できます。
「指紋」領域：主要な分子の同定
スペクトルの近赤外領域（約4000～400 cm⁻¹）は、分子を振動させます。異なる化学結合（タンパク質のC=O、脂質のC-Hなど）は、特徴的な周波数で振動します。
約1800～900 cm⁻¹の領域は、特定の分子に固有の複雑なピークパターンを含むため、「指紋領域」として知られています。この領域を分析することで、生体分子の主要なクラスを同定し、定量化することができます。
主要な技術：FTIR顕微鏡法
他の方法も存在しますが、FTIR顕微鏡法は、感度、速度、汎用性のバランスから、この分野の主力となっています。
なぜFTIRなのか？速度と感度
最新の フーリエ変換赤外分光法（FTIR） 装置は、古い方法とは対照的に、すべての周波数の光を同時に収集します。これにより、はるかに高い信号対雑音比と劇的に速い取得時間が得られ、これは生物サンプルの広範囲のマッピングに不可欠です。
「マイクロ」の利点：空間分解能
FTIR分光計を顕微鏡と組み合わせることで、IRビームを小さなスポットに集光できます。このビームをサンプル上でラスタースキャンするか、焦点面アレイ（FPA）検出器を使用することにより、数ミクロンから数十ミクロンのスケールで特徴を分解しながら、ピクセルごとにハイパースペクトル画像を構築できます。
核となる課題：水の影響の克服
生物サンプルのIR分析における最大の障害は 水 です。
水が問題となる理由
液体H₂Oは、近赤外領域、特に1640 cm⁻¹付近に非常に強くブロードな吸収帯を持ちます。この信号は非常に強いため、検出器を完全に飽和させ、タンパク質の構造と濃度を調べるために不可欠なタンパク質の重要な アミドI帯 をマスクしてしまう可能性があります。
解決策1：サンプルの乾燥と固定
最も一般的なアプローチは、水を除去することです。生物組織は通常、マイクロトームで切片化され、特別なIR透過性スライド（CaF₂やBaF₂など）上に配置され、その後乾燥されます。これは、空気乾燥、凍結乾燥（フリーズドライ）、またはホルマリンやエタノールなどの化学固定剤による処理によって行われます。これは標準的な組織学と同様であり、水の信号を効果的に排除し、残りの生体分子のクリーンで高品質なスペクトルを提供します。
解決策2：重水（D₂O）による同位体交換
生きた細胞など、より「ネイティブ」または水和された状態でサンプルを研究するために、H₂Oを 重水素化酸化物（D₂O）、すなわち「重水」と交換することができます。
D₂O中のO-D結合は、はるかに低い周波数（約1210 cm⁻¹）で吸収するため、巨大な水のピークが邪魔にならないように移動し、指紋領域におけるタンパク質、脂質、核酸のシグナルが露出します。
トレードオフの理解：測定モード
IR光がサンプルとどのように相互作用するかは、それぞれが明確な利点を提供する、もう一つの重要な選択です。
透過（Transmission）
透過モードでは、IRビームが非常に薄いサンプルを直接通過します。このモードは通常、最高品質で最も定量化可能なスペクトルを提供しますが、細心の注意を払って調製された薄い組織切片（通常5～10 µm）が必要です。
反射（Transflection）
より一般的には、サンプルはトランスフレクション（反射）モードで分析されます。組織は反射スライド（鏡面またはLow-eスライドなど）上に配置されます。IRビームはサンプルを通過し、スライドの表面で反射し、再びサンプルを通過して検出器に向かいます。これはより便利ですが、スペクトルアーチファクトを引き起こすことがあります。
全反射減衰法（ATR）
ATR-FTIRイメージング は、表面に高感度な強力な技術です。サンプルは、ゲルマニウムなどの高屈折率の結晶としっかりと接触させられます。IR光はサンプルを通過せず、代わりに「エバネッセント波」がサンプルの表面に数ミクロンだけ浸透します。これは、事前の準備なしに、厚いまたは強い吸収を持つサンプルの表面から高品質なスペクトルを取得するのに優れています。その短い光路長は水の干渉を自然に最小限に抑えるため、水和されたサンプルの分析に有力な選択肢となります。
IRバイオイメージングの新たな最前線
この分野は、速度と分解能の限界を押し広げる新技術によって常に進化しています。
シンクロトロンIR：究極の分解能のために
シンクロトロン光源を使用すると、従来の熱源よりも最大1000倍明るいIRビームが得られます。これにより、回折限界の空間分解能が実現し、単一細胞や細胞内小器官の化学イメージングが可能になります。
量子カスケードレーザー（QCL）：前例のない速度のために
広範囲の熱源の代わりに、これらのシステムは高出力でチューニング可能なレーザーを使用します。通常、完全なスペクトルを収集するわけではありませんが、数分ではなく数時間かかる可能性のある広範囲のサンプル上の特定の分子（総タンパク質や脂質など）をマッピングするために、いくつかの主要な周波数に調整できます。これは、ハイスループットな臨床応用の可能性を変革しています。
目標に合わせた適切な選択
技術とサンプル調製方法の選択は、完全にあなたの研究課題に依存します。
- 診断病理組織学が主な焦点である場合： 薄く、乾燥させ、固定した組織切片に対して透過モードまたはトランスフレクションモードでFTIR顕微鏡法を使用し、疾患の生化学的マーカーを特定します。
- 生きた細胞や動的プロセスの研究が主な焦点である場合： 水和状態を維持するために、ATR-FTIRイメージングを検討するか、培地をD₂Oと交換した後に密閉された液体セル内で作業します。
- 細胞内の化学分析が主な焦点である場合： シンクロトロンIR光源によって提供される高い輝度と空間分解能が必要になるでしょう。
- 多数のサンプルのハイスループットスクリーニングが主な焦点である場合： QCLベースのイメージングは、少数の主要なバイオマーカーの分布を迅速にマッピングするために必要な速度を提供します。
結局のところ、生物サンプルの赤外線イメージングを習得することは、最も重要な分子シグナルを分離するために変数を制御することなのです。
要約表：
| 技術 | 主な利点 | 最適な用途 |
|---|---|---|
| FTIR顕微鏡法 | 高感度と速度 | 組織の一般的な化学マッピング |
| ATR-FTIRイメージング | 最小限のサンプル調製、表面感度 | 水和サンプル、生きた細胞 |
| シンクロトロン-IR | 究極の空間分解能 | 細胞内分析 |
| QCLイメージング | 前例のない速度 | ハイスループットスクリーニング |
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